Wanneer men bij een patiënt aan MCTD denkt (op grond van het complex van klachten en bevindingen bij lichamelijk onderzoek), kan gekeken worden of bij bloedonderzoek zogenaamde anti-U1RNP antistoffen aanwezig zijn. Inmiddels weten we dat deze antistoffen gericht zijn tegen een complex van enkele aan RNA “klevende” eiwitten. In de meeste laboratoria wordt niet naar de titer aan anti-RNP antistoffen gekeken, maar wordt bepaald of ze wel of niet aantoonbaar zijn in bloed. Belangrijk is dat met deze technieken óók bij sommige patiënten met auto-immuunziekten die geen MCTD zijn (bijvoorbeeld SLE), deze antistoffen gevonden kunnen worden. Ze zijn dus NIET ziekte specifiek.

Naast dit gerichte immunologische onderzoek wordt uiteraard gekeken naar het aantal bloedcellen, de nierfunctie, het CPKgehalte in het bloed (verhoogde waarden kunnen op myositis wijzen) en de urine. Daarnaast is het vaak goed om (hetzij vanwege klachten, hetzij om een uitgangssituatie vast te leggen) aanvullend longfunctie- en hartonderzoek te doen. Wanneer er spierklachten of  klachten door aantasting van zenuwen zijn, kan een bepaald spieronderzoek, een  EMG (electromyografie), noodzakelijk zijn. De gegevens van deze onderzoeken kunnen ook bijdragen tot de diagnose.